Voltration/Gaintration: entendendo a titulação de voltagens e ganhos em citometria de fluxo

Por: Bárbara Du Rocher (Fiocruz-RJ / Explore Cytometry)

Em citometria de fluxo, ao excitarmos um fluorocromo, os elétrons deste fluorocromo passam para estados eletrônicos excitados. Após excitação, estes elétrons retornam aos seus estados basais, liberando parte da energia na forma de fótons fluorescentes (luz) que são captados pelos detectores do citômetro e convertidos em corrente elétrica. A questão é que essa corrente elétrica gerada possui um sinal muito baixo e, portanto, os citômetros precisam amplificar este sinal, processo realizado pelo sistema de detecção do citômetro (por exemplo, dos PMTs, que são fotomultiplicadores). Assim, toda vez que aumentamos a voltagem aplicada a um detector (ou o ganho, dependendo da máquina), aumentamos a intensidade do sinal detectado. De forma análoga, toda vez que diminuímos a voltagem aplicada a um detector (ou ganho), diminuímos a intensidade do sinal detectado. Portanto, um valor muito baixo de voltagem (ou ganho) pode resultar em uma baixa intensidade do sinal detectado, fazendo com que o sinal da população positiva fique muito próximo ao sinal da população negativa. Por outro lado, um valor muito alto de voltagem (ou ganho) pode resultar em uma alta amplificação do sinal positivo, fazendo com que o sinal sature o detector ou fique fora da escala de aquisição. Além disso, um valor muito alto de voltagem (ou ganho) pode amplificar o ruído eletrônico e o background, resultando em um espalhamento do sinal da população negativa (“spread” do sinal da população negativa). Resumindo: você pode piorar a relação sinal/ruído. Assim, muitas empresas adotaram um procedimento extra de qualidade que busca identificar as voltagens (ou ganhos) ideais para cada citômetro: o Voltration (ou gaintration). Assim, o voltration (ou gaintration, em citômetros que utilizam ganho eletrônico) nada mais é do que uma titulação das voltagens (ou ganhos) de um citômetro, objetivando definir o melhor valor de voltagem (ou ganho) que maximiza a resolução entre as populações positivas e negativas. Nesse processo, a mesma amostra marcada (Ex: PBMCs marcados com CD4 Alexa Fluor 488, em uma concentração final de 1:400) é adquirida múltiplas vezes variando-se apenas a voltagem (ou ganho) do detector correspondente ao fluorocromo avaliado. Ao final, com os valores das voltagens (ou ganhos) e das intensidades de fluorescência correspondentes construímos um gráfico de “Separation Index” e a partir dele determinamos qual voltagem (ou ganho) fornece a melhor separação entre as populações positivas e negativas para o fluorocromo testado. Em resumo, o voltration/gaintration busca encontrar um equilíbrio entre baixa amplificação e amplificação excessiva, permitindo uma melhor resolução das populações analisadas.

Amostra concatenada de um ensaio de voltration para o anticorpo anti-CD4 Alexa Fluor 488.

E você? Quando fará o voltration ou gaintration do seu citômetro? Bom experimento e vejo vocês no @explorecytometry!!!

Por Bárbara Du Rocher

Pesquisadora-tecnologista em citometria de fluxo pela Fiocruz, RJ e fundadora do Explore Cytometry (@explorecytometry), plataforma de mídias sociais voltada para a divulgação da citometria de fluxo.